行業(yè)資訊
采用加標(biāo)比對(duì)試驗(yàn)探索培養(yǎng)溫度和時(shí)間對(duì)酶底物法檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的影響;在確定*適培養(yǎng)條件后,采集飲用水水樣進(jìn)行檢測(cè)并通過16S rDNA序列GenBank比對(duì)試驗(yàn)對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行確證。結(jié)果表明,酶底物法檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的*適培養(yǎng)條件為39 ℃恒溫培養(yǎng)7 d,嗜肺軍團(tuán)菌檢出濃度與理論濃度基本一致,加標(biāo)回收率范圍為98.4%~108.8%;對(duì)北方城市部分飲用水水樣進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè),檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽性水樣4份,經(jīng)乳膠凝集血清分型試驗(yàn)和16S rDNA序列分析確認(rèn)均為嗜肺軍團(tuán)菌。
0 引言
軍團(tuán)菌(Legionella)是一種常見的水源性致病微生物,廣泛存在于各種水環(huán)境中,特別是在包括飲用水在內(nèi)的人工水體中。目前空調(diào)冷卻水、噴泉水等非飲用水中軍團(tuán)菌污染問題已引起各國研究者的廣泛關(guān)注,而飲用水中軍團(tuán)菌污染的相關(guān)研究較少。但近年來飲用水系統(tǒng)被軍團(tuán)菌污染事件時(shí)有發(fā)生,特別是2020年受新冠疫情的影響,多數(shù)建筑長期封閉導(dǎo)致供水系統(tǒng)長時(shí)間水流停滯,為軍團(tuán)菌的生長繁殖提供有利條件。2020年5至7月美國有報(bào)道稱,包括美國疾控中心多處辦公樓在內(nèi)的供水系統(tǒng)、度假酒店的自來水以及大學(xué)校園的建筑供水均檢出軍團(tuán)菌。感染軍團(tuán)菌可引起嚴(yán)重的呼吸道傳染病,其中嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila,LP)與人類疾病關(guān)系*為密切。目前我國現(xiàn)行《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749-2006)未對(duì)軍團(tuán)菌指標(biāo)提出控制要求,現(xiàn)有的微生物指標(biāo)也無法正確提示軍團(tuán)菌污染水平。但美國環(huán)保署(US-EPA)2001年頒布的《國家飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(EPA 816-F-09-004)中國家一級(jí)飲用水規(guī)程規(guī)定軍團(tuán)菌*大污染水平的控制目標(biāo)為零。世界衛(wèi)生組織(WHO)2011年發(fā)布的《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》第四版也已將軍團(tuán)菌列入12種水源性病原體之一,明確其衛(wèi)生學(xué)意義重大。
分離培養(yǎng)法是目前國際通用檢測(cè)軍團(tuán)菌的“專用標(biāo)準(zhǔn)”,適用于各種環(huán)境水體。但也有研究者提出該方法存在操作繁瑣,檢測(cè)周期較長,易受雜菌干擾等缺陷。近些年出現(xiàn)了多種新的嗜肺軍團(tuán)菌定量檢測(cè)方法。其中,酶底物法作為一種同時(shí)適用于飲用水和非飲用水的嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)方法備受關(guān)注。北美、歐洲、日本等國家相繼對(duì)該方法進(jìn)行了能力驗(yàn)證及應(yīng)用,普遍認(rèn)為酶底物法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏性高的特點(diǎn),可用于檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌。目前,我國還未對(duì)該方法在檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的可行性進(jìn)行研究?;诖?,本研究擬通過加標(biāo)試驗(yàn)對(duì)酶底物法檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌*適宜的培養(yǎng)條件進(jìn)行探索,并運(yùn)用該方法對(duì)飲用水水樣進(jìn)行檢測(cè)分析,為進(jìn)一步探索適用于飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)用菌種
試驗(yàn)所用的嗜肺軍團(tuán)菌質(zhì)控樣品NCTC 11192(ATCC 33152)購置于美國愛德士生物科技公司(IDEXX),單只質(zhì)控樣真值為1 604±335 MPN/100mL。
1.2 儀器和試劑
程控定量封口機(jī)(IDEXX),恒溫培養(yǎng)箱,渦旋振蕩器,生物安全柜,離心機(jī),水浴鍋,移液槍;酶底物培養(yǎng)基、定量盤(IDEXX),乳膠凝集試劑盒(OXOID),軍團(tuán)菌診斷血清試劑1-15型(天津生物芯片),BCYE和BCYECYE培養(yǎng)基(陸橋),QIAamp DNA Mini Kit試劑盒(QIAGEN)。
1.3 培養(yǎng)條件
1.3.1 方法原理
酶底物法是一種以細(xì)菌酶檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ),基于*可能數(shù)(most probable number, MPN)方法的定量檢測(cè)方法。嗜肺軍團(tuán)菌利用酶底物試劑中豐富的氨基酸、維生素和其他營養(yǎng)成分迅速生長繁殖,同時(shí)會(huì)利用額外添加的酶底物反應(yīng)生成一種棕色的指示物使溶液顯褐色或者渾濁。
1.3.2 培養(yǎng)條件設(shè)置
本研究擬對(duì)培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行考察。根據(jù)分離培養(yǎng)法中軍團(tuán)菌*適培養(yǎng)溫度為36±1℃以及酶底物法中建議的飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)溫度為39℃,本研究將培養(yǎng)溫度設(shè)定為5組:33℃、36℃、39℃、42℃、45℃,每個(gè)溫度條件設(shè)9個(gè)平行樣,并在培養(yǎng)箱中放入一個(gè)裝有足量水的托盤,以保持培養(yǎng)箱中濕度適宜。培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為11 d,樣品在培養(yǎng)過程中每隔24h觀察記錄96孔定量盤的顏色和濁度變化,從第1 d到第11 d持續(xù)觀察。
1.3.3 培養(yǎng)方法
嗜肺軍團(tuán)菌質(zhì)控樣品用適量無菌去離子水稀釋,配制成高、中、低(321±67 MPN/100mL、64±13 MPN/100mL、8±2 MPN/100mL)三種不同濃度的100mL菌懸液作為陽性待測(cè)樣品。在待測(cè)樣品中加入酶底物培養(yǎng)基,振蕩混勻并倒入96孔定量盤中,輕拍定量盤排出空氣后放入程控定量封口機(jī)中封口,*后將定量盤紙片一面朝下,在33℃、36℃、39℃、42℃、45℃溫度條件下培養(yǎng)。同時(shí),用無菌水代替陽性待測(cè)樣品,其他操作步驟同上述一致,設(shè)為陰性對(duì)照。
1.3.4 結(jié)果判讀
相對(duì)陰性對(duì)照而言,無論渾濁與否,任何顯褐色的跡象均認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌陽性;相對(duì)陰性對(duì)照而言,無論是否顯褐色,濁度大于陰性對(duì)照即認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌陽性;如顏色與濁度方面與陰性對(duì)照無差異,認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌陰性。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果,數(shù)出顯陽性的大小孔格數(shù),對(duì)照MPN表得到嗜肺軍團(tuán)菌濃度(MPN/100mL)。
1.4 飲用水水樣檢測(cè)
1.4.1 水樣的采集和檢測(cè)
?。?)采集水樣:于2020年6月隨機(jī)無菌采集北方某城市飲用水水樣,每份樣品100mL。水樣低溫運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室后室溫儲(chǔ)存,3 d內(nèi)進(jìn)行酶底物法檢測(cè)。
?。?)培養(yǎng)方法:用水硬度測(cè)試條測(cè)定水樣的硬度。根據(jù)水的硬度進(jìn)行預(yù)處理:0~2個(gè)顯色條呈陽性為低硬度,需向100mL水樣中加入酶底物補(bǔ)充劑0.33mL,3~4個(gè)顯色條呈陽性為高硬度,需向100mL水樣中加入酶底物補(bǔ)充劑1mL。加入酶底物培養(yǎng)基到混合液中,振蕩混勻,倒盤封口。按照條件探索試驗(yàn)確定的*適培養(yǎng)條件培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。結(jié)果判讀同1.3.4。
1.4.2 陽性孔確證試驗(yàn)
本研究同時(shí)采用血清凝集和16S rDNA測(cè)序兩種方法對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。
?。?)血清凝集法:用接種環(huán)取10 μL陽性菌懸液涂布于BCYE和BCYE-CYE培養(yǎng)基上,在CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)2~4 d。對(duì)在BCYE上生長、BCYE-CYE上無生長的菌落進(jìn)行血清凝集型別鑒定,可分出血清1-15型。
?。?)16S rDNA序列分析:DNA提取步驟按照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒說明書進(jìn)行;16S rDNA引物信息:引物F為5′-GTTAAGTCCCGCAACGA-3′;引物R為5′-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3′,由某基因科技有限公司合成。PCR體系:1 μL模板,15 μL Super Mix,1 μL Primer F(10p),1 μL Primer R(10p),12 μL ddH2O,共30 μL。反應(yīng)程序:96℃預(yù)變形5min;96℃變性20s,62℃退火20s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);*后,72℃延伸10min。擴(kuò)增后取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)并觀察條帶性狀;PCR產(chǎn)物純化按照磁珠純化標(biāo)準(zhǔn)操作流程操作;純化后的PCR產(chǎn)物由某基因科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析。
1.5 質(zhì)量控制
ATCC 33152為本次研究陽性對(duì)照質(zhì)控菌株。
1.6 統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。嗜肺軍團(tuán)菌加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果的比較采用單因素方差分析。
2 結(jié)果
2.1 培養(yǎng)條件
2.1.1 培養(yǎng)溫度
加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時(shí),嗜肺軍團(tuán)菌加標(biāo)回收率在21.3%~75%;當(dāng)培養(yǎng)溫度為36℃時(shí),嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度接近加標(biāo)濃度,加標(biāo)回收率在89.5%~105%;當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃時(shí),嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度與加標(biāo)濃度基本一致,加標(biāo)回收率在98.4%~108.8%;當(dāng)培養(yǎng)溫度為42℃時(shí),嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度偏低,加標(biāo)回收率在25.8%~51.4%;當(dāng)培養(yǎng)溫度為45℃時(shí),嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度明顯偏低,加標(biāo)回收率<34.6%。采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果顯示F=17.90,p<0.05,認(rèn)為5組數(shù)據(jù)有顯著性差異,具體數(shù)據(jù)見表1。單因素方差分析兩兩比較結(jié)果顯示,39℃組與36℃組數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.576)。
表1 不同培養(yǎng)溫度嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度(MPN/100mL)和加標(biāo)回收率(%)
注:經(jīng)單因素方差分析,p<0.05;
2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間
由圖1a可知,嗜肺軍團(tuán)菌陽性樣品在高濃度時(shí),當(dāng)培養(yǎng)溫度為45℃、42 ℃、39 ℃、36 ℃時(shí),第4 d開始出現(xiàn)陽性現(xiàn)象,45℃、42 ℃、39 ℃ 時(shí)第7 d結(jié)果趨于穩(wěn)定,36 ℃條件下第8 d結(jié)果趨于穩(wěn)定;當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時(shí),第6 d開始觀察到陽性現(xiàn)象,直到第11 d未觀察到連續(xù)穩(wěn)定結(jié)果即未達(dá)到*大檢出濃度。由圖1b可知,嗜肺軍團(tuán)菌陽性樣品在中濃度,培養(yǎng)溫度為42 ℃、39℃、36 ℃時(shí),第4 d開始觀察到陽性現(xiàn)象,并分別在第6 d、第7 d、第9 d結(jié)果趨于穩(wěn)定;當(dāng)培養(yǎng)溫度為45℃、33℃時(shí),第5 d開始觀察到陽性現(xiàn)象,并分別在第6 d和第10 d結(jié)果趨于穩(wěn)定。由圖1c可知,嗜肺軍團(tuán)菌陽性樣品在低濃度,培養(yǎng)溫度為45℃ 時(shí),未觀察到陽性現(xiàn)象,分析可能是溫度過高導(dǎo)致嗜肺軍團(tuán)菌死亡或者活性消失;當(dāng)培養(yǎng)溫度為42℃時(shí),在第5 d出現(xiàn)陽性現(xiàn)象,第6 d結(jié)果趨于穩(wěn)定;當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃、36℃時(shí),第4 d開始觀察到陽性現(xiàn)象,分別在第6 d和第9 d結(jié)果趨于穩(wěn)定;當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時(shí),在第6 d觀察到陽性現(xiàn)象,第10 d結(jié)果趨于穩(wěn)定。
圖1 不同濃度嗜肺軍團(tuán)菌隨時(shí)間變化生長曲線
2.2 飲用水水樣檢測(cè)
本研究采用酶底物法對(duì)采集的飲用水水樣進(jìn)行了嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè),共檢出嗜肺軍團(tuán)菌陽性樣品4份,分離獲得4株嗜肺軍團(tuán)菌,通過乳膠凝集血清學(xué)分型分別為1型、15型、7型、10型嗜肺軍團(tuán)菌;另外通過16S rDNA測(cè)序分析對(duì)其進(jìn)行菌株確證,結(jié)果顯示,分離的4株菌均屬嗜肺軍團(tuán)菌,表現(xiàn)為2種基因型,命名為Lp-1和Lp-NO.2。其中Lp-1有2株,對(duì)應(yīng)的血清型為1型和7型;Lp-NO.2有2株,對(duì)應(yīng)的血清型為10型和15型。根據(jù)Blast結(jié)果顯示,Lp-1株與CP048618.1 Legionella pneumophila親緣關(guān)系*近,相似性為1;Lp-NO.2與LR134380.1 Legionella pneumophila subsp. pascullei親緣關(guān)系*近,相似性為9977%?,F(xiàn)基于16S rDNA測(cè)序結(jié)果建立的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。
圖2 基于16S rDNA測(cè)序結(jié)果的嗜肺軍團(tuán)菌系統(tǒng)發(fā)育樹
3 討論
3.1 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間
培養(yǎng)溫度是影響嗜肺軍團(tuán)菌生長繁殖的重要因素,一般認(rèn)為軍團(tuán)菌可在20~50℃的水溫環(huán)境下生存,*佳生存溫度為25~42 ℃。研究表明,當(dāng)酶底物法培養(yǎng)溫度高至42℃以上或低至33℃以下時(shí),嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度均明顯低于理論濃度的50%,即加標(biāo)回收率均低于50%,說明高溫可以殺滅嗜肺軍團(tuán)菌或使其活性喪失,而溫度過低又會(huì)導(dǎo)致嗜肺軍團(tuán)菌活性降低,使顯色反應(yīng)延遲或不發(fā)生。本研究中,當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃和36℃時(shí),嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度值與理論濃度值基本一致,即均可達(dá)到較高的加標(biāo)回收率,為較適宜的培養(yǎng)溫度,且從圖2的指數(shù)增長曲線可以看出39℃時(shí)嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度比36℃時(shí)更接近理論濃度值,但未發(fā)現(xiàn)兩者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶底物法具有顯著的影響。相同溫度條件下,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,嗜肺軍團(tuán)菌檢出率增高。當(dāng)溫度≥39℃時(shí)指數(shù)增長階段集中在第4~7 d,當(dāng)溫度<39℃時(shí)指數(shù)增長階段集中在第4~10 d。結(jié)合培養(yǎng)溫度的研究結(jié)果,重點(diǎn)比較39℃和36℃培養(yǎng)溫度下嗜肺軍團(tuán)菌的生長趨勢(shì)。結(jié)果顯示,當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃時(shí),高中低濃度陽性樣品均能穩(wěn)定在第4 d開始出現(xiàn)陽性顯色現(xiàn)象,并在第6 d或第7 d達(dá)到*大檢出濃度;當(dāng)培養(yǎng)溫度為36℃時(shí),高中低濃度陽性樣品均在第4 d開始出現(xiàn)陽性顯色現(xiàn)象,并在第8 d或第9 d達(dá)到*大檢出濃度。綜合考慮培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間,在保持高回收率的同時(shí)盡可能縮短培養(yǎng)周期,本研究認(rèn)為酶底物法在39℃條件下,選擇7 d作為培養(yǎng)時(shí)間,嗜肺軍團(tuán)菌的檢出效果*好。
3.2 方法的特異性
本研究通過酶底物法對(duì)北方某城市的部分飲用水水樣進(jìn)行檢測(cè),共檢出嗜肺軍團(tuán)菌陽性4份,通過血清分型試驗(yàn)和16S rDNA序列分析對(duì)陽性樣品進(jìn)行確證,兩種確證方法結(jié)果一致,4份陽性樣品均為嗜肺軍團(tuán)菌。結(jié)果表明,本研究通過酶底物法檢測(cè)獲得的4份嗜肺軍團(tuán)菌陽性水樣特異性為1,這與Spies K等人的研究結(jié)果相同。
4 結(jié)論
嗜肺軍團(tuán)菌是飲用水中存在的潛在條件致病病原體。隨著城市化發(fā)展進(jìn)程加快,嗜肺軍團(tuán)菌在飲用水系統(tǒng)中滋生并傳播的風(fēng)險(xiǎn)日益增大。因此加強(qiáng)對(duì)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)和控制對(duì)保障用水安全至關(guān)重要。通過試驗(yàn)證明,酶底物法檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的*適宜培養(yǎng)條件為39℃恒溫培養(yǎng)7 d。在適宜條件下,酶底物法檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌具有良好的穩(wěn)定性和特異性,并具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果易于判讀等特點(diǎn),在檢測(cè)飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌領(lǐng)域具有良好的發(fā)展和應(yīng)用前景。